guionpracticas

PRÁCTICAS DE FUNDAMENTOS DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA

<> TRADUCCIÓN IN VITRO DE mRNAs
             .- Aislamiento de RNAs. <>
                         A) Preparación de extracto de tejido.
                         B) Aislamiento en columna de oligo dT-celulosa de la fracción poli-A⁺-RNA.
                         <>C) Cuantificación de RNAs. <>
             .- Traducción “in vitro”. <>
                        A) Preparación de lisado de reticulocitos.
                        B) Traducción “in vitro”. Síntesis de proteínas en lisado de reticulocitos a partir de la fracción poli-A⁺-RNA. Síntesis de proteínas                                                         en lisado de reticulocitos de un RNA exógeno.
                       C) Análisis de los productos de traducción. <>
                            -Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.
                            -Transferencia de los productos de traducción a membranas de nitrocelulosa.
                            -Detección mediante anticuerpos específicos contra productos de traducción.
                            -Revelado colorimétrico mediante ensayo enzimático (peroxidasa) de complejos antigeno-anticuerpo.

TRADUCCIÓN “IN VITRO” DE mRNAs-

En esta práctica, se pretende como objetivo general realizar la traducción de una fracción poli-A⁺-RNA mediante un sistema “in vitro” al objeto de analizar los productos de traducción correspondientes. Para ello, se realizará una extracción de RNA total, aislamiento de la fracción poli-A⁺-RNA en columna de oligo dT-celulosa, traducción en sistema de lisado de reticulocitos de conejo, análisis de los productos de traducción por electroforesis en gel de poliacrilamida, transferencia a membranas de nitrocelulosa, detección específica de productos de traducción y revelado mediante un sistema enzimático.

<>1- EXTRACCIÓN DE RNA.
<>
Materiales: <>

Reactivos:

Tiocianato de guanidina.

Citrato sódico.

Ácido cítrico.

2-mercaptoetanol

N-laurilsarcosina (Sarcosilo).

Acetato Sódico

Ácido acético glacial.

Fenol.

Cloroformo

Alcohol isoamílico.

Isopropanol.

Etanol absoluto.

NaCl

Tris (Trihidroximetilaminometano)

SDS (Dodecil sulfato sódico)

<>
Instrumental:

Homogeneizador de Potter.

Centrífuga de alta velocidad con tubos y adaptadores.

<>
Nota: Todas las soluciones se prepararán en H₂O destilada estéril previamente tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).

Todas las manipulaciones del experimento se realizarán con material estéril y utilizando guantes de laboratorio desechables.

Soluciones

<> La solución desnaturalizante contiene 4 M tiocianato de guanidina, 25 mM citrato sódico pH 7, 0.1 M 2-mercaptoetanol, 0.5% N-laurilsarcosina (Sarcosilo). Se prepara una solución stock disolviendo 250 g de tiocianato de guanidina en una solución de 293 ml de H₂O, 17.6 ml de citrato sódico 0.75 M pH 7 y 26.4 ml de 10% Sarcosilo a 60-65ºC con agitación. La solución “stock” puede ser almacenada hasta 3 meses a temperatura ambiente. Inmediatamente antes de su utilización se añaden 0,35 ml de 2-mercaptoetanol por cada 50 ml de solución “stock”. Esta nueva solución puede ser almacenada durante 1 mes a temperatura ambiente.

La solución de acetato sódico se prepara añadiendo 16.42 g de acetato sódico anhidro a 40 ml de H₂O y 35 ml de ácido acético glacial. Se ajusta la solución a pH 4 con ácido acético glacial y el volumen final a 100 ml con H₂O. La solución es 2 M con respecto a los iones sodio.

La solución de fenol se prepara disolviendo 100 g de cristales de fenol en H₂O a 60-65ºC. Se aspira la fase acuosa superior y se puede almacenar hasta 1 mes a 4ºC.

El tampón HS contiene 0.5 M NaCl, 10 mM Tris pH 7.5, SDS 0.5 %.

Procedimiento

Se extrae como tejido de partida cerebro de rata realizando su homogeneización a 0-4ºC en baño de hielo fundente.

Se añaden 10 ml de solución desnaturalizante por gramo de tejido.

Homogeneización en homogeneizador Potter pasando el homogeneizado a tubo Falcon estéril.

Se añade 1 ml de solución 2 M NaAcO.

Se añaden 10 ml de fenol saturado con agua, según se describe su preparación en el apartado de soluciones.

Se añaden 2 ml de cloroformo/alcohol isoamílico (49:1 ; v/v).

Se incuban 15 min. a 0-4ºC. Centrifugar 20 min. a 9 000 x g a 4ºC.

Se recoge la fase superior.

Se añaden 10 ml de Isopropanol y se deja precipitar 30 min. a -20ºC.

Se centrifuga 10 min. a 10 000 x g a 4ºC. Se retira cuidadosamente el sobrenadante.

Se lava el sedimento con 75% Etanol.

Se centrifuga 10 min a 10.000 x g a 4ºC. Retirar cuidadosamente el sobrenadante.

Se disuelve el sedimento en 1 ml de Tampón HS.

La concentración de ácido nucleico se determinó espectrofotométricamente por medida de la absorbancia de la solución problema a 260 nm; para ello se asumió que 20 unidades de A260 en una cubeta de 1 cm de paso de luz equivalen a una concentración de ácido nucleico de 1 mg/ml. Debería haber 500 µg de RNA total. El RNA total obtenido se almacena a -80ºC

El poli(A)+ RNA se aisló por cromatografía en oligo(dT)-celulosa.

<> CUESTIONES:

1.- ¿Qué función cumple el tiocianato de guanidina?

2.- ¿En qué fase se encuentra el RNA en el proceso de aislamiento?

3.-¿Para que se añade isopropanol?.

4.- ¿Qué cantidad de RNA total se obtiene en la muestra final?.

5.- ¿Cuál es el rendimiento del proceso de aislamiento?.

<>
2- AISLAMIENTO DE FRACCIÓN POLI-A⁺-RNA.

Materiales

<>Reactivos: <>

OligodT-celulosa. La resina de oligo-dT-celulosa se preparó tratando 0.5-1

<> gramo de polvo de oligodT-celulosa con 0.1 N NaOH. Para ello, se

suspende el oligo dT-celulosa en vaso de precipitados añadiendo la

solución de sosa con agitación magnética. Se centrifugó a 3.000 rpm

<> durante 5 min. a temperatura ambiente. Se retira la solución de sosa tras

centrifugación y se resuspende el sedimento en tampón HS.

NaCl

Tris

SDS (Dodecil sulfato sódico).

LiCl

Etanol absoluto

<>
Instrumental:

Minifuga Eppendorf.

<>
Nota: Todas las soluciones se prepararán en H₂O destilada estéril previamente tratada con dietilpirocarbonato (DEPC).

Todas las manipulaciones del experimento se realizarán con material estéril y utilizando guantes de laboratorio desechables.

Procedimiento

Utilizar una pipeta Pasteur estéril como columna. Introducir en ella lana de vidrio como soporte de la resina a cargar en la columna. Coger una alicuota de oligodT-celulosa preparada previamente según se describe en materiales.y cargar en la pipeta Pasteur hasta alcanzar 5 mm de lecho. Lavar con agua estéril.

Equilibrar la columna con 2 ml de Tampón HS.

Añadir el RNA total (100-200 µl) y pasar lento.

Lavar con 10 ml de tampón HS.

Añadir 100 µl de 0.5% SDS en H₂O.

Comenzar a recoger fracciones de elución de la columna en alícuotas sobre tubos Eppendorf estériles, eluyendo con 0.5% SDS (1,2-1,5 ml) .

Recoger alícuotas de 100 ml (al menos 10 alícuotas).

Una vez finalizada la cromatografía, añadir a cada alícuota, 10 µl de 2 M LiCl y 250 µl de EtOH absoluto.

Dejar de 3 a 16 horas a -20ºC.

Centrifugar 10 min. en minifuga a 4ºC.

Aspirar el sobrenadante.

Lavar el sedimento 2 veces con 250 ml de 75% EtOH.

Disolver el sedimento en 10 µl de H₂O estéril.

Se toman 1-2 µl para la traducción.

El sedimento final de poli(A)⁺ se disolvió a 0ºC en agua destilada estéril, dejándose a una concentración aproximada de 1 mg/ml. Por tanto, se deben medir absorbancias a 260 nm como se describió anteriormente. La solución se conservó a -70ºC hasta su uso.

CUESTIONES:

1.- ¿Cómo se produce el aislamiento de fracción poli-A⁺-RNA en oligo-dT-celulosa?.

2.- ¿Sirve este procedimiento para el aislamiento de mRNA específico de una determinada proteína?.

3.- ¿Qué procedimiento podría utilizarse para aislar a partir de la fracción poliA⁺-RNA, un mRNA específico de una determinada proteína?.

4.- ¿Qué cantidad de RNA se obtiene tras el aislamiento en oligodT-celulosa?.

5.- ¿Cuál es el rendimiento del proceso?.

3- PREPARACIÓN DEL SISTEMA DE LISADO DE RETICULOCITOS DE CONEJO.

<> Los sistemas de traducción de lisado de reticulocito de conejos se utilizan en la identificación de especies de mRNA, la caracterización de sus productos proteicos y en la investigación del control transcripcional y traduccional. Se prepara en conejos blancos de Nueva Zelanda usando el protocolo descrito más adelante. Los reticulocitos se purifican para retirar células contaminantes, que pueden alterar las propiedades traduccionales del extracto final. Después de lisar los reticulocitos, se trata el extracto con nucleasa micrococal para destruir el mRNA endógeno y reducir la traducción de fondo al mínimo. El lisado contiene los componentes celulares necesarios para la síntesis de proteínas (tRNA, ribosomas, aminoácidos, factores de iniciación, elongación y terminación). El lisado de reticulocito de conejo está optimizado para la traducción de mRNA mediante adición de:

Un sistema generador de energía conteniendo fosfocreatina y fosfocreatina quinasa.

Una mezcla de tRNAs para expandir el rango de mRNAs que pueden ser traducidos.

Hemina para prevenir la inhibición de la iniciación.

Acetato potásico y acetato magnésico.

<> El lisado de reticulocito de conejo contiene una variedad de actividades postraduccionales incluyendo acetilación, isoprenilación y alguna actividad de fosforilación.

El sistema de lisado de reticulocitos de conejo se puede obtener de la siguiente forma:

2 conejos que se inyectaron subcutáneamente con acetil-fenil hidracina al 1.2% (p/v), disuelta en solución salina (0.14 M NaCl, 15 mM Mg(AcO)₂ y 5 mM KCl) neutralizada con Hepes 1 M pH 7.5. Las inyecciones se hicieron según el esquema siguiente:

Día 1, 2 ml de acetil-fenil hidracina; día 2, 1,6 ml; día 3, 1,2ml; día 4, 1,6 ml y día 5, 2 ml. El día 7 se sangraron los conejos y se recogieron aproximadamente 20 ml de sangre en un recipiente que contenía 20 ml de solución salina anterior y heparina 0.001 % (p/v). La solución resultante se filtró con gasa y se centrifugó a 4ºC (2.000 x g, 5 min). El sedimento celular se lavó 3 veces con solución salina por resuspensión y centrifugación; la última centrifugación se realizó a 4.000 x g. Se midió el volumen de células empaquetadas y se lisaron con un volumen igual de agua destilada a 0ºC. Se dejó un minuto a 0ºC y se centrifugó a 4ºC (14.000 x g, 20 min). Se tomó el sobrenadante (aproximadamente 4,5 ml) que se trató inmediatamente con nucleasa de micrococo.

El tratamiento con nucleasa de micrococo se realizó de la siguiente forma:

Por cada 100 volúmenes de lisado de reticulocitos se añadieron: 1 volumen de Hemina de concentración 4 mg/ml, 2 volúmenes de CaCl₂50 mM, 1 volumen de creatín fosfo-quinasa de concentración 16 mg/ml en glicerol/agua 50% (v/v) y un volumen de nucleasa de micrococo de concentración 1 mg/ml y se incubó a 20ºC durante 15 min. Al cabo de este tiempo se paró la reacción mediante la adición de 2 volúmenes de EGTA 100 mM (neutralizado con KOH). El lisado así tratado se repartió en alícuotas de 40 y 80 µl que se guardaron inmediatamente a -70ºC.

<> CUESTIONES:

1.- ¿Qué efecto tiene la inyección de fenilhidracina?.

2.- ¿Por qué se trata el lisado de reticulocito con nucleasa micrococal?.

3.- ¿Cómo se para la reacción de la nucleasa micrococal?.

4- TRADUCCIÓN IN VITRO

Se pueden emplear volúmenes de ensayo de 25 µl que contenían 10 µl de lisado de reticulocitos tratado con nucleasa y las siguientes concentraciones finales: espermidina 8 mM, 0.08 µCi/µl de Metionina-[³⁵S], DTT 80 mM, Hepes 40 mM, pH 7.6, KAcO 100 mM, Mg (AcO)₂ 0.25 mM y una concentración variable del ácido nucleico exógeno a ensayar. Se incubó a 37ºC durante 30 min. y se determina, a continuación, la radioactividad total incorporada en proteínas. Se llevó en paralelo un ensayo sin ácido nucleico exógeno para obtener la radiactividad neta incorporada.

En la práctica se realizará una determinación de los productos de traducción no mediante análisis de radioactividad sino utilizando un revelado colorimétrico tras electroforesis, transferencia e incubación con anticuerpos específicos.

El sistema de traducción que se utiliza permite la detección no radioactiva de proteínas sintetizadas “in vitro”. Usando estos sistemas, se produce la síntesis de las proteínas nacientes durante la traducción a partir de los mRNA aislados previamente. Posteriormente, los productos de traducción se identifican mediante anticuerpos específicos y revelado mediante reacción enzimática con peroxidasa.

<>
El uso de este sistema ofrece varias ventajas:

En primer lugar el no tener que manejar o almacenar material radioactivo.

La reacción de identificación es específica al utilizar anticuerpos contra determinadas proteínas que se quieren identificar.

Los resultados pueden ser visualizados rápidamente mediante detección colorimétrica.

Protocolo de traducción

<> Componente Volumen Concentración final

Lisado de reticulocito 10 µl

Mezcla de aminoácidos

(menos leucina) 1 mM 0.5 µl

Mezcla de aminoácidos

(menos metionina) 1 mM 0.5 µl

RNA sustrato en agua (1 µg/µl) 2 µl

DTT (ditiotreitol) 0,8 M 2,5 μl 80 mM

Espermidina 0,08 M 2,5 μl 8 mM

Hepes 1 M pH 7,6 1 μl 40 mM

KAcO 2,5 M 1 μl 100 mM

Mg(AcO)₂ 2,5 mM 2,5 μl 0,25 mM

Agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 25 µl

El RNA sustrato será una muestra de mRNA objeto de estudio. En nuestro caso, utilizaremos la muestra de poli-A⁺RNA añadiendo diferentes cantidades del mismo, un control de mRNA de luciferasa y un blanco.

Las concentraciones finales de los componentes del lisado de reticulocitos de conejo añadidos a 25 µl de reacción de traducción.

Componente Concentración

Creatina fosfato 10 mM

Creatina fosfoquinasa 50 µg/ml

DTT 80 mM

tRNA de hígado de ternera 50 µg/ml

Acetato potásico 100 mM

Acetato magnésico 0.25 mM

Hemina 0.02 mM

La incubación para la traducción “in vitro” se realiza a 30ºC durante 90 minutos.

<>
CUESTIONES:

1.- ¿Cómo funciona el sistema generador de energía del lisado de reticulocitos de conejo?.

2.- ¿Por qué se añade DTT a la mezcla de traducción?.

3.- ¿Por qué se añade K⁺ y Mg^{+2 a la mezcla de traducción?.}

4.- ¿Qué función cumple la hemina?.

5- ANALISIS DE PROTEÍNAS TRADUCIDAS.

<>
5.1 Electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS.

Materiales:

Fuente de electroforesis

Cubeta de electroforesis con cristales, peines y separadores.

Acrilamida.

Bisacrilamida.

Tris (Trihidroximetilaminometano).

HCl.

SDS (Dodecilsulfato sódico).

Temed.

Persulfato amónico.

Glicina.

Azul de bromofenol.

glicerol

2-mercaptoetanol.

Marcadores de peso molecular.

Baño de incubación

Soluciones:

Tampón de Ruptura x 5 que contiene: 2,5 ml de solución de SDS 10% 0,2 ml de 2-mercaptoetanol, 0,5 ml de azul de bromofenol 0,05%, 0,3 ml de tampón de electroforesis, 1 ml de glicerol y 0,5 ml de Tris 0,5 M pH 6,8.

El tampón de electroforesis contiene 14,4 g/l de glicina, 3 g/l de Tris (base) y 10 ml/l de SDS 10%.

<>Procedimiento:

Se prepara un gel separador y una vez polimerizado sobre él se añade el gel concentrador.

Gel separador (7.5%):

Agua destilada 12 ml.

Acrilamida/Bisacrilamida 6,25 ml

Tris 1 M pH 8.8 6,25 ml

SDS 10% 250 µl

Temed 12,5 µl

Persulfato amónico 200 µl

(100 mg/ 1 ml)

<>
La solución de acrilamida contiene 30 % acrilamida + 0.8 % bisacrilamida. Manejar esta solución con guantes y pipetear con propipeta.

Dejar polimerizar el gel y sobre él añadir el gel concentrador

<>
Gel concentrador :

Acrilamida/Bisacrilamida 1,65 ml

Tris pH 6.8 0.5 M 2,5 ml

Agua 5,8 ml

SDS 10 % 100 μl

Temed 6,5 µl

Persulfato amónico 94 µl

(100 mg/ml)

Una vez polimerizado aplicar la muestra. Para ello se toman varias cantidades de la mezcla de traducción (2 , 4, 6 µl ) y se añade a la muestra, tampón de ruptura x 5 en una relación 4:1 (volumen:volumen). Se mantiene la muestra 3-5 min en baño a ebullición. Se añade al pocillo. Se completa el pocillo con buffer de ruptura x 1 preparado diluyendo el buffer de ruptura x 5 en tampón de electroforesis.

Se procede a correr la electroforesis hasta que el frente de azul de bromofenol alcance el borde del gel separador aplicando una diferencia de potencial de 30-40 voltios.

<>
CUESTIONES:

1.- ¿En el gel separador en una electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS, qué proteinas presentan mayor movilidad electroforética?.

2.-¿Qué sustancia se usa como marcador de frente?.

3.- ¿Por qué se utilizan dos geles (concentrador y separador) en la electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de SDS?.

4.- ¿Qué posibles aplicaciones presenta este método?.

5.- ¿Qué patrón de bandas se obtiene en la muestra de marcadores?.

5.2 Transferencia de proteínas de gel de poliacrilamida a filtro de nitrocelulosa.

Materiales:

Fuente de electroforesis

Cubeta de transferencia

Membranas de nitrocelulosa

Papel Whatman nº 1.

Tris

Glicina

Metanol

<>Soluciones:

Tampón de transferencia conteniendo 20 mM Tris, 150 mM glicina y 20%

metanol.

<>Procedimiento:

Una vez finalizada la electroforesis se retira el gel, se equilibra en tampón de transferencia con varios cambios (3 x 5 min). Se coloca sobre él una membrana de nitrocelulosa previamente equilibrado en el mismo buffer y se realiza la transferencia en una cubeta de transferencia para húmedo colocando el gel en proximidad del cátodo y el filtro de nitrocelulosa en proximidad del ánodo. Se realiza la transferencia durante 2 horas a 200 mA/ 100 V.

<>
5.3 Identificación de productos de traducción.

Incubación con anticuerpos anti-tubulina. Revelado colorimétrico de los filtros de celulosa.

<>Materiales:

Tris

NaCl

Tween-20

Solución de tinción que contiene.

Anticuerpo primario antitubulina (Suero antitubulina preparado en conejo por inyección como inmunógeno de proteína microtubular de cerebro de embrión de pollo de trece días).

Anticuerpo secundario. Anticuerpo comercial que reconoce IgGs de conejo se une al anticuerpo primario y que lleva unida peroxidasa como enzima que permite el revelado de la membrana.

Agitador orbital.

Estufa.

<>Soluciones:

Tampón TBS: Tris Buffer Salino conteniendo Tris 50 mM - 6.05 g/l-, NaCl 140 mM -8.20 g/l.

Tampón TBST: Tris Buffer Salino conteniendo Tris 50 mM - 6.05 g/l-, NaCl 140 mM -8.20 g/l conteniendo 0,5% Tween 20.

Solución de tinción que contiene Azul de Coomassie , ácido acético, metanol.

Solución de destinción que contiene Acido acético 10%, metanol 10% en agua.

Procedimiento:

Una vez finalizada la transferencia se tiñe el gel de electroforesis mediante su inclusión en solución de tinción durante 2 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, se pasa a solución de destinción destiñendo el gel durante toda la noche.

La membrana de nitrocelulosa se trata realizando dos lavados de 10 minutos con tampón TBS y 0.5% Tween 20 incubando a temperatura ambiente con agitación constante.

A continuación se bloquea con leche desnatada en polvo 5% en TBS.

Se lava con TBST dos veces, 10 minutos cada lavado.

Se añade el anticuerpo primario a una dilución 1:100 en TBST conteniendo 5% leche desnatada en polvo. Se incuba 1 hora a temperatura ambiente.

Se realizan 5 lavados de 15 minutos cada uno con TBST a temperatura ambiente.

Se añade el anticuerpo secundario a una dilución 1:1000 en TBST conteniendo 5% leche desnatada en polvo. Se incuba 1 hora a temperatura ambiente.

Se realizan 5 lavados de 15 minutos cada uno con TBST a temperatura ambiente.

<> Se realiza el revelado con una mezcla comercial para anticuerpos conjugados a peroxidasa que produce señal luminiscente.

Se mezclan para ello 1 ml de solución A con 1 ml de solución B.

Se añade sobre la membrana. Se espera durante 1 min. Se revela exponiendo la membrana sobre filme radiográfico.
<>

CUESTIONES:

1.- ¿Cómo se realiza la detección de los productos de traducción sobre la membrana de nitrocelulosa?.

2.- ¿Qué patrón de bandas se obtiene de los productos de traducción tras revelado de la membrana de nitrocelulosa? ¿Por qué?.